面对一张由 Input、IgG、IP 和 IB 组成的条带图，很多初学者仍然会困惑：怎么看关键条带，可以得到什么结论？Input 有条带说明什么？只做一个方向够不够？

今天学霸菌就从实验原理出发，系统解读 Co-IP 结果图。

Co-IP 究竟在检测什么？

Co-IP 的核心思想可以概括为一句话：先把目标蛋白从复杂裂解液中结合出来，再观察另一个蛋白是否一起被带出来。

如果我们想验证蛋白 A 与蛋白 B 是否存在相互作用，需要进行的步骤有：

• 使用识别蛋白 A 的抗体与细胞裂解液孵育；

• 抗 A 抗体与蛋白 A 结合；

• Protein A/G 磁珠捕获「抗体—蛋白 A」复合物；

• 经过多次洗涤，去除未结合或非特异结合的蛋白；

• 对沉淀物进行 Western blot，并用抗 B 抗体检测；

如果沉淀中出现蛋白 B 条带，说明蛋白 B 与蛋白 A 共同存在于被捕获的复合物中。

图 1：Co-IP 原理示意图（codex）

常见标注「IP：A，IB：B」的含义是：使用抗 A 抗体进行免疫沉淀，再使用抗 B 抗体进行免疫印迹检测。IB 也常写作 WB。

需要特别注意的是：Co-IP 证明的是两种蛋白在实验条件下存在于同一复合物中，并不能单独证明二者发生直接的物理结合。蛋白 A 和蛋白 B 之间可能还存在蛋白 C 等桥接分子。

结果图中的 Input、IgG 和 IP 分别代表什么？

一张合格的 Co-IP 结果图，通常至少包括 Input、IgG 对照和特异性 IP 组三部分。

图 2：读懂 Input、IgG 对照和特异性 IP 组的意义（codex）

所以，一张完整结果图至少回答两个问题：

• 抗 A 抗体是否成功沉淀了蛋白 A？

• 在确认蛋白 A 被成功捕获的前提下，蛋白 B 是否被共同沉淀？

Co-IP 结果应该怎么判读？

常见的是验证两个蛋白相互结合：Input 组确认样本正常表达蛋白 X 和 Y；IgG 组作为阴性对照，排除非特异性结合产生的假阳性；IP 组（Anti-X）在成功沉淀蛋白 X 的同时共沉淀出蛋白 Y，从而证明 X 与 Y 存在相互作用。

图 3：Co-IP 示意图（https：//www.univ-bio.com/feature.html？id=38）

内源性 Co-IP 与外源性 Co-IP，需要都做吗？

图 4：内源 IP 和外源 IP 的原理示意图（//blog.csdn.net/mmmm12134/article/details/144719454）

外源性 Co-IP

外源性 Co-IP 通常通过转染带有 Flag、HA、Myc 等标签的表达质粒完成。其优点是抗标签抗体性能稳定、蛋白容易检测，适合早期筛选互作关系和进行结构域分析。

图 5：外源性 GRP75 可以增强 ANT2 和 UCP1 的相互作用

（//blog.csdn.net/mmmm12134/article/details/144719454）

内源性 Co-IP

内源性 Co-IP 不依赖过表达，直接检测细胞或组织中天然表达的蛋白复合物，更接近生理状态，因此通常具有更强的生物学说服力。它的难点是内源蛋白丰度较低，对抗体质量、裂解液配方、样本量和操作条件要求更高。

图 6：内源性 ANT2 和 GRP75 的相互作用（https：//blog.csdn.net/mmmm12134/article/details/144719454）

为什么 Co-IP 阳性仍不能证明「直接结合」？

假设蛋白 A 与蛋白 C 直接结合，蛋白 C 又与蛋白 B 结合。当抗 A 抗体沉淀整个复合物时，蛋白 B 也会被带下来。此时 Co-IP 结果为阳性，但 A 与 B 之间并没有直接接触。

例如：判断 EZH2 和 MTA1 的结合，JARID 是连接蛋白。

首先检测 JARID 的表达降低，说明构建的 JARID 敲低模型成功（右侧）。在看 Input 中对照组和处理组表达相同，再看对照组 EZH2 和 MTA1 正常结合，而敲低连接蛋白 JARID 后，EZH2 和 MTA1 基本不结合（左侧）。

图 7：Co-IP 结果示意图（doi: 10.1038/s41586-024-07529-3)

因此，Co-IP 结果更严谨的表述是：蛋白 A 与蛋白 B 可发生共沉淀，提示二者存在于同一蛋白复合物中。

若要进一步证明直接结合，可以采用纯化蛋白 pull-down、表面等离子共振、微量热泳动、生物层干涉等体外实验；若要证明细胞内空间接近，可结合免疫荧光共定位、PLA 邻近连接分析或 FRET 等技术。

抗体重链、轻链在结果中的判读

常规 IP 抗体在洗脱和变性后也会进入胶中，并被 Western blot 二抗识别，因此常在约 50 kDa 和 25 kDa 附近出现 IgG 重链和轻链条带。如果目的蛋白分子量恰好位于这些区域，结果很容易受到干扰。

常用解决方案包括：

• 将 IP 抗体交联到磁珠或琼脂糖珠上；

• 使用只识别天然一抗、不识别变性 IgG 的二抗体系；

• 选择轻链特异性二抗；

• 更换标签、检测方向或胶浓度，使目的条带避开抗体链；

• 直接标记用于 Wb 检测的一抗，减少二抗识别 IP 抗体的干扰。

图 8：Co-IP 结果重链、轻链的示意图（知乎）

直接标记用于 Western blot 检测的一抗，减少二抗识别 IP 抗体的干扰。读图时要结合分子量判断，不能把约 50 kDa 的强条带自动认作目的蛋白。

Co-IP 图，不能只看实验组有没有条带，更要看起始表达、沉淀效率、阴性对照及归一化是否完整。读懂这些信息，才能得到正确的实验结论，转化为经得起推敲的蛋白互作证据。

编辑：冷漠小 z

题图：自制